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簡單和快速地幫抗體鍵結上螢光、小分子或酵素，適合多螢光觀察實驗

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一、產品介紹

Biotium 研發的 Mix-n-stain 套組可以快速和簡單地幫抗體鍵結上螢光、小分子或酵素，獨家研發的試劑操作非常簡單，優化過的反應緩衝液和化學基團使得實驗者自己就可以完成抗體標記 (圖四、圖五)。使用標記螢光的一抗優點在於可以省下二抗的反應時間，以及可以一次使用多種宿主相同的一抗進行不同螢光的標記。Biotium 研發的 Mix-n-stain 標記的螢光一抗和使用二抗的效果相同，可以大幅減少反應時間。
適用的抗體類型為多株抗體或是 IgG 單株抗體。除了29種的新型 CF 螢光染劑之外，還有螢光染劑 Cyanine 555、Cyanine 647、FITC，以及小分子 Biotin、DIG、DNP，還有三種酵素可以選擇 Alkaline Phosphatase (AP)、Glucose Oxidase (GOx)、HRP。這些小分子皆為直接鍵結，因此只需要少量的反應時間 (圖四)。除了直接鍵結之外，Biotium 還針對螢光蛋白研發出專用套組，透過 linker 鍵結上大分子螢光蛋白 R-PE (PE)、APC、PerCP 以及 tandem dyes RPE-CF®647T、APC-CF®750T。大分子蛋白使用間接的方式鍵結，因此需要較長的反應時間 (圖五)。
Tandem dyes 指的是有兩個螢光分子接在一起，例如 phycobiliprotein + CF dye。透過 fluorescence resonance energy transfer 螢光共振能量轉移，有 donor 的 excitation 特性和 acceptor 的 emission 特性。通常只會用在 flow cytometry，因為轉移效率不是百分百，但如此可以創造出更多的螢光可以使用，相同的激發光可以有不同的放射光。
 

二、產品優點

1. 大幅減少螢光免疫染色時間：
Mix-n-stain 標記的螢光一抗和使用二抗的效果相同，可以大幅減少反應時間(圖一)。
圖一
上圖：HeLa 細胞以 anti-tubulin antibody 偵測，分成使用 CF®488A 二抗或 CF®488A Mix-n-Stain™ 標記後的腹水一抗。
下圖：Rat optic nerve cryosections 以 anti-GFAP 偵測。分成使用 CF®568 二抗或 Mix-n-Stain™ CF®568 標記後的腹水一抗。此兩圖顯示此套組標記的螢光效果和二抗相當。

2. 鍵結非常穩定：
螢光和抗體為共價鍵結，因此可用於多螢光實驗，螢光分子不會擴散或轉移到其他抗體上。同時因為其高穩定性，鍵結完的抗體可以於4oC 保存半年。(鍵結酵素或螢光蛋白的抗體因為鍵結物是蛋白質的關係，只能於4oC 保存一個月) (表一)

3. 多種包裝可選擇：
針對要鍵結的抗體量作選擇 5 ug-100 ug，三種包裝5-20 ug, 20-50 ug, 50-100 ug (如果為兩種包裝之間，建議選擇小包裝)，另有提供1 mg 大包裝。(請見訂購資訊)

4. 29種螢光和多種小分子及酵素可供選擇：
29種 CF dyes 可供選擇，另有 Cyanine 555、Cyanine 647、FITC，以及小分子 Biotin、DIG、DNP，還有三種酵素可以選擇 Alkaline Phosphatase (AP)、Glucose Oxidase (GOx)、HRP，和大分子螢光蛋白 R-PE (PE)、APC、PerCP 以及 tandem dyes RPE-CF®647T、APC-CF®750T。

5. 反應時間超快，只要30分鐘 (僅限於 CF dyes 和小分子)：
優化過的試劑使得反應時間只要30分鐘，而酵素和大分子蛋白的反應時間較久，Alkaline Phosphatase (AP)、Glucose Oxidase (GOx) 需要兩小時；HRP 需要三小時；R-PE (PE)、APC、PerCP 需要四小時；RPE-CF®647T、APC-CF®750T 需要兩小時。其他螢光染劑 CF dyes 和小分子都只需要30分鐘。(表一)

6. 操作簡單且快速：
僅有簡單的吸取溶液和離心，操作非常簡單，且操作時間很短，CF dyes 部分只要30秒，其他則是幾分鐘 (圖四、圖五)。

7. 不需要純化且背景值低：
反應時間過後，所有未鍵結的染劑、小分子或螢光蛋白會失去活性，無法再鍵結其他抗體，因此螢光染色實驗中不會標記上其他抗體。另外，由於 CF 染劑水溶性非常好，因此於螢光免疫染色實驗中，清洗的步驟會去除掉未鍵結的染劑，不會影響實驗觀察。

8. 可以忍受干擾物：
試劑經過特別優化，可以忍受 glycine、Tris、glycerol、sodium azide 和其他蛋白質 (BSA & gelatin)，但需要特別的操作步驟，因此在實驗前必須仔細檢查抗體儲存溶液的成分，對照 protocol 中的 checklist，找出適合的步驟 (圖六)。附贈有濃縮管 (Ultrafiltration Vial)，可以濃縮抗體或是去掉鹽類雜質。(各種類適用的抗體濃度皆不同，請見表一)

9. 比起他牌 (Thermo, Expedeon) 效率更好：
Thermo 有出 Zenon Antibody Labeling Kits，使用 antibody fragments 來標記，而 Biotin 是共價鍵結，因此有以下優點：

(a) 螢光染劑不會轉移到其他抗體；
(b) 不像 Zenon 有物種專一性；
(c) 鍵結完成後可以儲存半年以上，Zenon 必須於30分鐘以內使用；
(d) Mix-n-stain 的染劑比較小，因為為直接鍵結，Zenon 為間接鍵結，鍵結物較大；
(e) Mix-n-Stain 的鍵結抗體於染色後不需要固定。
Expedeon 有出 Lightning-Link® Rapid antibody labeling kits，但是 Biotium 獨家研發的 CF dyes 本身更穩定，螢光強度也更強 (圖二)。
圖二：Mouse anti-transferrin receptor antibody 以 Lightning-Link® Rapid DyLight® Conjugation Kits (Novus Biologicals) 和 Mix-n-Stain™ CF® Dye Antibody Labeling Kits (Biotium) 標記上螢光。Biotium 的 Mix-n-stain 螢光訊號較強。左右兩圖使用相同的參數，左圖的左上框框使用 higher gain setting。

10. 特殊技術鍵結大分子螢光蛋白質：
由於蛋白質和蛋白質的作用較困難，Biotium 研發出特殊技術，先在抗體上加上 linker，再鍵結上修飾過的大分子螢光蛋白，提高鍵結效率。
圖三：Jurkat 細胞以一抗mouse anti-CD3 標記，並以 Anti-mouse 二抗標記上 APC，使用 Mix-n-Stain™ APC Labeling Kit 或 Mix-n-Stain™ 標記的抗體的背景值 (without primary antibody) 較低 (pink)，而且訊號值較高 (blue).
 

三、產品資訊

Label Dye Ex/Em Catalog Labeling
5-20 ug antibody		 Catalog Labeling
20-50 ug antibody		 Catalog Labeling
50-100 ug antibody		 Catalog Labeling
1mg antibody
CF®350 347/448 nm 92270 92250 92230 92420
CF®405S 404/431 nm 92271 92251 92231 92421
CF®405M 408/452 nm 92272 92252 92232 92404
CF®405L 395/545 nm 92303 92304 92305 x
CF®430 426/498 nm 92316 92317 92318 x
CF®440 440/515 nm 92319 92320 92321 x
CF®450 405/460 nm 92322 92323 92324 x
CF®488A 490/515 nm 92273 92253 92233 92405
CF®514 516/548 nm 92331 92332 92333 x
CF®532 527/558 nm 92289 92290 92291 x
CF®543 541/560 nm 92287 92267 92247 x
CF®555 555/565 nm 92274 92254 92234 92406
CF®568 562/583 nm 92275 92255 92235 92407
CF®570 568/591 nm 92334 92335 92336 x
CF®583 583/606 nm 92237 92238 92239 x
CF®594 593/614 nm 92276 92256 92236 92408
CF®633 630/650 nm 92277 92257 92237 92409
CF®640R 642/662 nm 92278 92258 92245 x
CF®647 650/665 nm 92279 92259 92238 92410
CF®660C 667/685 nm 92280 92260 92239 x
CF®660R 663/682 nm 92281 92261 92243 x
CF®680 681/698 nm 92282 92262 92240 92422
CF®680R 680/701 nm 92283 92263 92246 x
CF®700 695/720 nm 92425 92426 92427 x
CF®750 755/777 nm 92284 92264 92241 92423
CF®770 770/797 nm 92285 92265 92242 92424
CF®790 784/806 nm 92288 92268 92248 x
CF®800 797/816 nm 92428 92429 92430 x
CF®820 822/835 nm 92431 92432 92433 x
Cyanine 555 555/565 nm 92412 92413 92414 92415
Cyanine 647 650/665 nm 92416 92417 92418 92419
FITC 494/518 nm 92294 92295 92296 92411
Biotin x 92286 92266 92244 x
DIG x 92328 92329 92330 x
DNP x 92325 92326 92327 x

Mix-n-Stain™ Enzyme Antibody Labeling Kits
Label Labeling size(ug antibody) Catalog
Alkaline Phosphatase (AP) 25-50 ug 92314
50-100 ug 92315
Glucose Oxidase (GOx) 25-50 ug 92312
50-100 ug 92313
HRP 10-20 ug 92300
25-50 ug 92301
50-100 ug 92302

Mix-n-Stain™ Enzyme Antibody Labeling Kits  
Label Dye Ex/Em Labeling size (ug antibody) Catalog
R-PE (PE) 496, 546, 565/578 nm 25-50 ug 92298
50-100 ug 92299
APC 650/660 nm 25-50 ug 92306
50-100 ug 92307
PerCP 482/677 nm 25-50 ug 92308
50-100 ug 92309
RPE-CF®647T 496/665 (PE-Cy®5 channel) 25-50 ug 92340
50-100 ug 92341
1 mg 92346
APC-CF®750T 650/780 nm (APC-Cy®7 channel) 25-50 ug 92310
50-100 ug 92311


四、注意事項：
1. Mix-n-stain 系列的標記套組皆為共價鍵結反應，因此反應完成的鍵結物非常穩定，於4oC 可以儲存半年以上 (部分儲存一個月，請見表一)。
2. 此套組各種溶液皆經過優化，因此能夠忍受多種干擾物 (圖六)，還附贈濃縮管以去除雜質。
3. 基本上為一次性使用。
4. CF 染劑及其他小分子為直接鍵結，每一個抗體接上約4-6個分子。
5. 適用的抗體類型為多株抗體或是 IgG 單株抗體。
6. 每種類型適用的抗體濃度不同，請見表一。超過需要稀釋，太稀則需要濃縮。
圖四：此步驟針對29種 CF 螢光染劑、螢光染劑 Cyanine 555、Cyanine 647、FITC，以及小分子 Biotin、DIG、DNP，反應為一步就位，只要30分鐘。酵素的標記步驟略有不同，需要較長時間，請參考原廠步驟 (請點我連結)。
 
圖五：此步驟適用於大分子螢光蛋白 R-PE (PE)、APC、PerCP，由於蛋白質和蛋白質的作用較困難，Biotium 研發出特殊技術，先在抗體上加上 linker，再鍵結上修飾過的大分子螢光蛋白，提高鍵結效率。Tandem dyes 步驟略有不同，反應時間只需要2小時，請參考原廠步驟。 (請點我連結)。
 
圖六：此為反應前的 checklist，需要檢查抗體儲存溶液中的鹽類和蛋白質濃度，每種不同狀況會有不同的反應條件。如果是融合瘤細胞上清液或是血清的抗體，由於雜質太多，必須以其他試劑先純化抗體，其他的狀況都可以直接使用此套組。此步驟適用於29種 CF 螢光染劑、螢光染劑 Cyanine 555、Cyanine 647、FITC，以及小分子 Biotin、DIG、DNP，酵素和大分子蛋白的 checklist 請參考原廠步驟。


表一：各類型標註物的適合標記抗體濃度 (Suitable Ab conc.)、反應時間 (Reaction time) 和鍵結的抗體的保存時間 (Conjugate Storage time)
Type Suitabe Ab conc. Reaction time Conjugate Storage time
29 CF dyes 0.5-1 mg/mL 30 mins 6 months at 4oC
FITC, cyanine 555/647
Biotin, DNP, DIG
Maxi Labeling 1 mg/mL
AP, GOx 1-2 mg/mL 2 hours 1 month at 4oC
HRP 3 hours
R-PE (PE), APC, PerCP 4 hours
RPE-CF®647T, APC-CF®750T 2 hours
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